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OptiVitro®无血清细胞冻存液-常见问题

Q1:产品是否为GMP级别?
A:依科赛的无血清生产车间是按照GMP标准建设的车间,依科赛SFM产品的质量体系是按照医疗器械的GMP规范建设。
Q2:冻存液我收到后直接放-20℃了,还能正常使用吗?
A:冻存液冻存后并不会影响冻存液的性能,但是由于冻存时体积增加,可能会导致密封性受到影响,可在4摄氏度融化后用0.22um的滤膜过滤后使用。
Q3:是否接受定制?
A:可以根据您的要求提供定制服务,但需要先和emc易倍的研发人员进行详细沟通,您可以先将您的具体需求告诉我,以便研制中心进行评估。

OptiVitro® 重组胰酶消化液 RF01-常见问题

Q1:使用本产品是否需要加入胰酶终止液?
A:本产品为温和消化酶,无需胰酶抑制剂终止。

OptiVitro® MSC无血清基础培养基-常见问题

Q1: 产品储存注意事项?
A :基础培养基2-8℃储存,避光。添加组分-20℃储存,避免反复冻融。
Q2:产品是否需要额外添加物质?
A:本产品为kit包装,将基础培养基+添加组分进行配制即可得到完全培养基,可直接进行细胞培养,无需添加额外物质;本产品不含有抗生素成分,如有需要可自行添加。
Q3:消化MSC出现细胞难消化、细胞损伤等问题如何处理?
A:推荐配套使用依科赛温和消化酶RF01(货号:RF000-N031),消化能力提高,细胞损伤小,存活率高;

OptiVitro® CHO无血清基础培养基-常见问题

Q1:培养基中是否含有L-谷氨酰胺?使用时,是否需要添加?
A:CHO无血清基础培养基CE01、CHO补料培养基CA01α和CHO补料培养基CA01β均不含有L-谷氨酰胺。CHO-K1/gs-宿主细胞,CHO-DG44/dhfr-宿主细胞极其克隆株使用上述产品时,需要额外添加L-谷氨酰胺,终浓度建议4-8mM,其他细胞株均不需要额外添加L-谷氨酰胺。
Q2:培养基中是否含胰岛素、生长因子、蛋白水解物或者多肽?
A:CHO无血清基础培养基CE01、CHO补料培养基CA01α和CHO补料培养基CA01β均不含有胰岛素、生长因子、植物/动物蛋白水解以及多肽等,是不含有任何蛋白质/多肽的、无动物源性、化学成分完全明确的培养基。
Q3:培养基中是否含有抗结团剂
A:CHO无血清基础培养基CE01含有抗结团剂;CHO补料培养基CA01α和CHO补料培养基CA01β不含。

OptiVitro® 293细胞无血清培养基-常见问题

1. 是否需要添加谷氨酰胺?
需要额外添加终浓度为 6mM 的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺易降解,可每次使用培养基时加入谷氨酰胺,或者分装部分培养基添加谷氨酰胺后一周内使用。
2. 不同体系培养基适应和驯化?
1)需要在培养过程中额外添加终浓度为6 mM的谷氨酰胺;加入谷氨酰胺(Gln)后需一周内使用;
2)不可反复放置于37℃预热。如需37℃预热,可于每次使用前分出所需体积,放于37℃预热,剩余体积及时放回2-8℃冰箱保存;
3)如果细胞原来在其他品牌培养基里培养,可直接用本培养基产品传代培养,传代 3 次(9-10 天)后细胞可适应本培养基产品,活率、细胞密度稳定,可进行后续实验。
4)如果原悬浮293细胞是用其他品牌培养基培养后冻存的,请用冻存时使用的细胞培养基来复苏细胞,传一代后换成本培养基产品,再传代 3 次、细胞状态稳定,可进行后续实验。使用本培养基产品培养后冻存的细胞,则可以使用本培养基产品复苏
3. 如何进行转染?
新复苏的细胞至少需要传代 4 次、且活率达到 90%以上再进行转染,转染前根据需要调整细胞密度为 2-3×106cells/mL。将质粒、转染试剂分别加入无菌 PBS(或转染专用稀释液)中稀释,室温静置 5 分钟。将转染试剂稀释液缓慢加入到质粒稀释液中,混匀,室温孵育 10-20 分钟。将质粒-转染试剂混合物加入悬浮 293 细胞培养液中,放入培养箱中培养。转染后无需换液,48-72 小时后可进行转染效率检测、收获蛋白或病毒等操作。
本培养基产品支持 PEI、脂质体等转染试剂。如细胞密度为 2×106cells/mL,建议添加质粒量为 1µg/mL;如细胞密度为 3×106cells/mL,建议添加质粒量为 1.5µg/mL。如使用 PEI 转染试剂,PEI 与质粒的质量比例建议为 3:1。
4. 如何提高转染?
支持 PEI、脂质体等转染试剂,质粒、转染试剂的稀释推荐用Opti-MEM 培养基(GIBCO 品牌)或无菌 PBS。混合后的转染试剂和质粒加入到293培养体系中,体积占比一般不会超过10%。
5. 如何测定病毒滴度?
1)QPCR法:使用根据慢病毒DNA设计的引物,用慢病毒裂解物为底物进行QPCR分析,根据标准曲线确定慢病毒滴度。
优点:定量、精确; 缺点:非活性计数。
2)稀释法:使用稀释的表达荧光蛋白的慢病毒感染细胞,尽量使1个细胞只接受1个慢病毒感染,72小时后根据荧光细胞数量计算慢病毒滴度。
优点:计算慢病毒活性;缺点:只能用于表达荧光蛋白的慢病毒。
3)流式分析检测:使用表达荧光蛋白的慢病毒感染细胞,使用流式细胞仪分析荧光细胞比例。
优点:快捷方便;缺点:无法定量。

OptiVitro® NK细胞无血清培养基-常见问题

1. 冻存的PBMC细胞可以用吗?
冻存的PBMC细胞可以使用,但是培养效果明显弱于新鲜PBMC。对于冻存的PBMC,建议激活前一天进行静息,即将细胞加入到含有NK培养基、不含包被因子的培养瓶中,放入培养箱过夜再进行激活。
2. 不加血浆效果如何?
扩增效果下降,对于初始NK较低的可能效果更差。
3. 人AB血清能否代替血浆?
可以。
4. 可以支持的细胞培养密度?
培养瓶培养建议4-5 E6/ml ; 袋子建议最高3-4 E6/ml(密度高影响生长,不同培养袋可能表现不同)。
5. 通用型NK客户无法使用血浆怎么办?
可选择NK比例较大的donor。
6. 高分选NK的客户能否使用?
完全可以,应提高血浆比例至5%,接种密度可以适当降低,接种密度范围:0.5-2x10^6 cells/mL。
7. iPS-NK客户能否使用?
有客户使用基础培养基(N012)搭配自有平台因子成功培养iPS-NK 。
8. 培养皿/培养瓶是否需要TC-treated?
需要。
9. 能否使用滋养层细胞?
可以,滋养层细胞可替代细胞因子I和II, 对于某些滋养层细胞,可加IL-2使用,某些滋养层细胞不能单纯加IL-2,仍然需要其他细胞因子,emc易倍有扩增基础试剂盒可以使用。
10. 激活后NK细胞扩增试剂盒P01提供的培养基不够怎么办?
NK细胞扩增基础试剂盒P01(NE000-N032)含有基础培养基、添加组分和细胞因子III,支持细胞扩增,与NK细胞扩增试剂盒P01(NE000-N022)配合使用。

OptiVitro® T细胞无血清培养基-常见问题

1. 组分:
本产品每1L基础培养基配发8mL添加组分,添加组分不是ICSR或者血替,化学成分明确,可放心使用,必须配成完全培养基后再使用;——可以提供成分说明及TSE/BSE的申明。
2. T细胞激活方式:
使用本产品,可根据说明书用抗体包板方式进行激活,也可购买商业抗体偶联磁珠进行激活,本产品同样支持磁珠激活。
3. 活率:
直接培养PBMC,D5后活率可达90%以上,从PBMC中分选出T细胞,则D3开始活率可达到90%以上,D7后活率均可达到95%以上;如果转导CAR,转导当天活率显著下降,为正常现象,继续培养活率会持续上升。
4. 培养方式:
使用本产品,比较推荐的培养方式是D0天激活,D3、D5、D7补充培养液将细胞密度调整到0.5-1x10^6cells/ml,D7后可选择2天或3天补一次液。
5. T细胞扩增速度:
T细胞的扩增在D3-D9速度较快,基本平稳,D9细胞扩增倍数一般可以达到200倍以上。D9后细胞扩增速度逐渐减缓,激活PBMC中的T细胞,最多可培养20天。
6. 高密度培养:
静置培养,密度可达5-6x10^6 cells/ml,摇瓶培养或其他震荡培养方式,密度可达10x10^6 cells/ml以上。
7. CD4/CD8比例调节:
使用本产品并且用磁珠激活,CD4比例较高,用抗体包板激活则CD8比例较高,可以通过改变激活方式、改变抗体包板浓度,调节CD4/CD8比例。
8. T细胞亚型分群:
Tn为初始T细胞,Tcm为中央记忆型T细胞,Tem为激活的Tcm,Tef为效应T细胞,分群比例随着细胞培养的时间而变化。不同客户对分群的要求可能不同,且不同激活方式、细胞因子的选择以及浓度,对分群影响很大,建议客户自行测试。
9. T细胞转导:
根据客户反馈测试数据,本产品阳性率可达到50%左右,但是不同客户使用的工艺不同,可能导致阳性率有变化。CAR慢病毒转导,可使用polybrene辅助转导,逆转录病毒转导可使用retronectin辅助转导,也有许多新型辅助因子可提高转导效率;采用离心转导的方式可提高转导效率。
10. T细胞生物反应器培养:
静置培养后D5-D7开始在反应器中培养,在达到目标体积之前,可以2-3天补液细胞密度调整到0.5-1x10^6 cells/ml,到达目标体积后可以采取部分灌流策略。

DNA Standards有扩增,而文库没有或Ct很大

1、文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。 2、稀释度过高。减少稀释倍数,重复实验。 3、文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用,用完丢弃。

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